Spectrofotometrie is een experimentele techniek die wordt gebruikt om de concentratie van een opgeloste stof in een bepaalde oplossing te meten door de hoeveelheid licht te berekenen die door die stof wordt geabsorbeerd. Deze techniek is erg handig omdat bepaalde verbindingen ook verschillende golflengten van licht bij verschillende intensiteiten absorberen. Door het licht dat door een oplossing gaat te analyseren, kunt u de in de oplossing opgeloste verbindingen en hun concentraties identificeren. Het hulpmiddel dat wordt gebruikt om oplossingen met deze techniek in het laboratorium te analyseren, is een spectrofotometer.
Stap
Deel 1 van 3: Het monster voorbereiden
Stap 1. Zet de spectrofotometer aan
De meeste spectrofotometers moeten worden opgewarmd voordat ze nauwkeurige metingen kunnen geven. Dus start de machine en laat deze vervolgens minimaal 15 minuten staan voordat u het monster meet.
Gebruik deze tijd om het monster voor te bereiden
Stap 2. Reinig de kuvet of reageerbuis
In schoollaboratoria kunnen wegwerpreageerbuisjes beschikbaar zijn die niet eerst schoongemaakt hoeven te worden. Als u echter een gewone kuvet of reageerbuis gebruikt, moet u het apparaat voor gebruik grondig reinigen. Spoel alle cuvetten af met gedeïoniseerd water.
- Wees voorzichtig met het gebruik van cuvetten, deze zijn vrij duur.
- Raak tijdens het gebruik van de cuvet de kant waar het licht doorheen gaat (meestal de heldere kant van de container) niet aan.
Stap 3. Giet voldoende monster in de cuvet
Het maximale volume van een deel van de cuvet is 1 ml, terwijl het maximale volume van de reageerbuis 5 ml is. Uw metingen moeten nauwkeurig zijn zolang het licht van de spectrofotometer nog door het monster kan gaan en niet door een leeg deel van de container.
Als u een pipet gebruikt om monsters in te brengen, gebruik dan voor elk monster een nieuwe tip. Zo kan kruisbesmetting worden voorkomen
Stap 4. Bereid de controleoplossing voor
Deze oplossingen, ook wel blanco's of blanco's genoemd, bevatten alleen het oplosmiddel in de te analyseren oplossing. Als u bijvoorbeeld een monster van zout hebt opgelost in water, is de blanco oplossing die u nodig hebt water. Als het water dat u gebruikt rood is, moet u ook een rode blanco oplossing gebruiken. Gebruik een vergelijkbare container om de blanco oplossing in hetzelfde volume als het monster te houden.
Stap 5. Veeg de buitenkant van de cuvet schoon
Voordat u de cuvet in de spectrofotometer plaatst, moet u ervoor zorgen dat deze schoon is om interferentie met de metingen door stofdeeltjes of onzuiverheden te voorkomen. Gebruik een pluisvrije doek om waterdruppels of stof te verwijderen die aan de buitenkant van de cuvet vastzitten.
Deel 2 van 3: Experimenteren
Stap 1. Bepaal en pas de golflengte van het licht aan om het monster te analyseren
Gebruik een enkele golflengte van licht (monochromatische straal) om de effectiviteit van de meting te vergroten. Kies de lichtkleur die kan worden geabsorbeerd door de chemische inhoud waarvan wordt aangenomen dat deze in het testmonster is opgelost. Stel de golflengte in volgens de specificaties van de spectrofotometer die u gebruikt.
- In schoollaboratoria worden deze golflengten meestal gegeven in de experimentele instructies.
- Omdat het monster al het zichtbare licht zal reflecteren, is de golflengte van de kleur van het experimentele licht meestal altijd anders dan de kleur van het monster.
- Een object heeft een bepaalde kleur omdat het een bepaalde golflengte weerkaatst en alle andere kleuren absorbeert. Gras lijkt groen omdat het chlorofyl erin groen reflecteert en andere kleuren absorbeert.
Stap 2. Kalibreer de spectrofotometer met een blanco oplossing
Plaats de blanco oplossing in de cuvettehouder en sluit de spectrofotometer. Op het scherm van de analoge spectrofotometer bevindt zich een naald die beweegt op basis van de intensiteit van de lichtdetectie. Nadat de blanco oplossing is ingebracht, moet de naald naar rechts bewegen. Noteer deze waarde voor het geval u deze later nodig heeft. Laat de blanco oplossing in de spectrofotometer blijven en schuif de naald vervolgens naar nul met behulp van de instelknop.
- Digitale spectrofotometers kunnen ook op dezelfde manier worden gekalibreerd. Deze tool is echter uitgerust met een digitaal scherm. Stel de aflezing van de blanco oplossing in op 0 met de bedieningsknop.
- Zelfs als de blanco oplossing uit de spectrofotometer wordt verwijderd, is de kalibratie nog steeds geldig. Dus wanneer u het hele monster meet, wordt de absorptie van de blanco automatisch verminderd.
Stap 3. Verwijder de blanco en test de kalibratieresultaten van de spectrofotometer
Zelfs nadat de blanco oplossing uit de spectrofotometer is verwijderd, moet de naald of het nummer op het scherm nog steeds 0 aangeven. Plaats de blanco oplossing terug in de spectrofotometer en zorg ervoor dat de meting niet verandert. Als de spectrofotometer correct is gekalibreerd met een blanco oplossing, moet het resultaat op het scherm nog steeds 0 zijn.
- Als de naald of het getal op het scherm geen 0 aangeeft, herhaalt u de kalibratiestappen met een blanco oplossing.
- Als het probleem aanhoudt, zoek dan hulp of laat iemand de spectrofotometer controleren.
Stap 4. Meet de absorptie van het monster
Verwijder de blanco oplossing en plaats het monster in de spectrofotometer. Wacht ongeveer 10 seconden totdat de wijzers zich stabiliseren of de cijfers op het digitale display niet meer veranderen. Noteer het percentage transmissie en/of absorptie van het monster.
- Hoe meer licht er wordt doorgelaten, hoe minder licht wordt geabsorbeerd. Gewoonlijk moet u de absorptiewaarde van het monster noteren, die over het algemeen wordt uitgedrukt als een decimaal getal, bijvoorbeeld 0,43.
- Herhaal de meting van elk monster minstens drie keer en bereken vervolgens het gemiddelde. Op die manier zullen de resultaten die u krijgt nauwkeuriger zijn.
Stap 5. Herhaal het experiment met verschillende golflengten van licht
Uw monster kan verschillende verbindingen bevatten die verschillende absorpties hebben, afhankelijk van de golflengte van het licht. Om de onzekerheid te verminderen, herhaalt u de monstermetingen met intervallen van 25 nm golflengte over het lichtspectrum. Op deze manier kunt u andere opgeloste chemicaliën in het monster detecteren.
Deel 3 van 3: Absorptiegegevens analyseren
Stap 1. Bereken de transmissie en absorptie van het monster
De transmissie is hoeveel licht door het monster kan gaan en de spectrofotometer kan bereiken. Ondertussen is absorptie de hoeveelheid licht die wordt geabsorbeerd door een van de opgeloste chemicaliën in het monster. Er zijn veel moderne spectrofotometers die output geven in de vorm van transmissie en absorptie. Als je echter een lichtintensiteitswaarde krijgt, kun je deze twee waarden ook zelf berekenen.
- De transmissie (T) kan worden bepaald door de intensiteit van het licht dat door de monsteroplossing gaat te delen door de hoeveelheid licht die door de blanco oplossing gaat. Deze waarde wordt meestal uitgedrukt als een decimaal getal of een percentage. T = I/I0, waarbij I de monsterintensiteit is en I0 is de blanco intensiteit.
- Absorptie (A) wordt uitgedrukt als een negatieve basis 10 logaritme (exponent) transmissie: A = -log10T. Dus, als T = 0, 1, A = 1 (0, 1 is 10 tot de macht -1). Dit betekent dat 10% van het licht wordt doorgelaten, terwijl 90% wordt geabsorbeerd. Ondertussen, als T= 0,01, A = 2 (0,01 is 10 tot de macht -2). Dit betekent dat het licht dat wordt doorgelaten 0,1% is.
Stap 2. Maak een grafiek van de absorptiewaarde versus de golflengte
Druk de absorptiewaarde uit als de y-as en de golflengte als de x-as. Van de punten van alle absorptieresultaten in elke golflengte, krijgt u het absorptiespectrum van het monster en identificeert u de inhoud van de verbinding en de verhouding ervan in het monster.
Absorptiespectra hebben meestal pieken bij bepaalde golflengten. Met deze piekgolflengten kunt u specifieke verbindingen identificeren
Stap 3. Vergelijk uw absorptiespectrum met een grafiek van een bekende verbinding
Elke verbinding heeft een uniek absorptiespectrum en heeft bij elke meting altijd dezelfde piekgolflengte. Door de grafiek die u krijgt te vergelijken met een grafiek van een bepaalde bekende verbinding, kunt u het gehalte aan opgeloste stof in de monsteroplossing identificeren.
