Gramkleuring is een snelle techniek en wordt gebruikt om de aanwezigheid van bacteriën in een weefselmonster te zien en om de bacteriën te classificeren als Gram-positief of Gram-negatief, op basis van de chemische en fysische eigenschappen van hun celwanden. Gramkleuring wordt bijna altijd gebruikt als de eerste stap bij het diagnosticeren van een bacteriële infectie.
Deze kleurtechniek is genoemd naar de Deense wetenschapper Hans Christian Gram (1853 - 1938), die de techniek in 1882 ontwikkelde en in 1884 publiceerde als een techniek om onderscheid te maken tussen twee soorten bacteriën met vergelijkbare klinische symptomen: Streptococcus pneumoniae (ook bekend als Streptococcus pneumoniae) pneumokokken) en de bacterie Klebsiella pneumoniae.
Stap
Methode 1 van 3: De microscoopglaasje voorbereiden
Stap 1. Bereid je voor om in het laboratorium te werken
Draag handschoenen en een stropdas van lang haar om bacteriële besmetting van het monster dat u test te voorkomen. Reinig de werkruimte onder een zuurkast of in een andere goed geventileerde ruimte. Controleer de bunsenbrander en zorg ervoor dat de microscoop goed werkt voordat u begint.
Stap 2. Steriliseer het microscoopglaasje
Als het glasplaatje vuil is, was het dan met zeepsop om olie en vuil te verwijderen. Reinig de objectglaasjes met ethanol, glasreiniger of een andere methode die door uw laboratorium wordt gebruikt.
Stap 3. Plaats het monster op het glasplaatje
U kunt de Gram-kleuringstechniek gebruiken om bacteriën in een medisch monster te identificeren, of een kweek van bacteriën die in een petrischaaltje groeien. Gebruik voor de beste resultaten Gram-kleuring op dunne streken van het monster. Het is raadzaam om monsters te gebruiken die minder dan 24 uur oud zijn, omdat oudere bacteriën hun celwanden mogelijk hebben beschadigd en mogelijk niet reageren op Gram-kleuring.
- Als u een weefselmonster gebruikt, voeg dan 1-2 druppels toe aan een glasplaatje. Verdeel gelijkmatig over het objectglaasje om een dun laagje monster te besprenkelen door het te schuiven met behulp van de rand van het andere steriele objectglaasje. Laat het drogen voordat u de volgende stap uitvoert.
- Als je bacteriën uit een petrischaal haalt, steriliseer dan de inentingslus in een bunsenbrander totdat deze gloeit en laat hem vervolgens afkoelen. Gebruik de lus om steriel water op het objectglaasje te druppelen, steriliseer het en laat het weer afkoelen voordat je het gebruikt om een klein bacteriemonster te verzamelen. Roer daarna voorzichtig om.
- De bacteriën die in de bouillon zijn bereid, moeten opnieuw worden geroerd met een vortexer en vervolgens worden ingenomen met de inoculatielus zoals hierboven, zonder toevoeging van water.
- Als je een uitstrijkje hebt (meestal gedaan met een klein wattenstaafje), raak dan het wattenstaafje aan en draai het voorzichtig over het glaasje.
Stap 4. Een iets hogere temperatuur kan een goede uitstrijk maken
Door de hitte blijven de bacteriën bovenop het glaasje, zodat ze niet gemakkelijk oplossen tijdens het kleurproces. Tik de schuif twee tot drie keer snel boven een bunsenbrander, of verwarm de schuif boven een elektrische schuifverwarmer. Niet oververhitten, het monster kan beschadigd raken. Als je een bunsenbrander gebruikt, moet het een kleine maar blauwe vlam zijn in plaats van een grote oranje vlam.
Als alternatief kan ook een uitstrijkje worden gemaakt met methanol, door 1-2 druppels methanol toe te voegen aan een droog uitstrijkje en de resterende methanol op het objectglaasje te drogen door het in de open lucht te laten staan. Deze techniek minimaliseert celbeschadiging en zorgt voor een schone dia-afbeeldingsachtergrond
Stap 5. Plaats de dia over de kleurplaat
Kleurplaten zijn gemaakt van metaal, glas of ondiepe plastic platen met een zacht gaas aan de bovenkant. Plaats de glaasjes bovenop deze netten, zodat de vloeistof die je gebruikt in de bak kan worden afgevoerd.
Als je geen kleurplaat hebt, kun je een dia op een plastic schaal plaatsen om ijsblokjes te printen
Methode 2 van 3: Gramkleuringsproces
Stap 1. Giet de kristalviolette vloeistof over het uitstrijkje
Gebruik een pipet om een bacteriemonster te besproeien met een paar druppels kristalviolette kleurstof, ook wel gentiaanviolet genoemd. Laat het 30-60 seconden staan. Kristalviolet (KV) scheidt in waterige oplossing in KV+ en chloride (Cl-) ionen. Deze ionen dringen de celwanden en celmembranen van zowel grampositieve als gramnegatieve bacteriën binnen. Het KV+-ion interageert met de negatief geladen componenten van de bacteriecellen, waardoor de cellen een paarse kleur krijgen.
Veel laboratoria gebruiken "Hucker" kristalviolet, dat ammoniumoxalaat bevat om neerslag te voorkomen
Stap 2. Spoel het kristalviolet voorzichtig af
Kantel de glijbaan en gebruik een wasfles om een kleine stroom gedestilleerd water of kraanwater over de glijbaan te spuiten. Water moet over het oppervlak van het uitstrijkje lopen en mag niet rechtstreeks op het uitstrijkje worden gespoten. Niet overmatig spoelen. Het kan vlekken in Gram-positieve bacteriën verwijderen.
Stap 3. Spoel het uitstrijkje met jodium en spoel het daarna uit
Gebruik een druppelaar om het uitstrijkje met jodium door te spoelen. Laat het minstens 60 seconden intrekken en spoel het daarna zorgvuldig uit op dezelfde manier als hierboven. Jodium, in de vorm van een negatief geladen ion, interageert met KV+ om een groot samengesteld complex te vormen tussen kristalviolet en jodium (CV-I-verbindingscomplex) in de binnenste en buitenste lagen van de cel. Dit complex van verbindingen behoudt de violette kleur van het kristalviolet in de cel, op de gekleurde locaties.
Jodium is een bijtende stof. Vermijd inademing, inslikken of contact met de huid
Stap 4. Voeg kleurbleekmiddel toe en spoel het daarna snel af
Een 1:1-mengsel van aceton en ethanol wordt meestal gebruikt voor deze belangrijke stap, die zorgvuldig moet worden getimed. Plaats het glaasje in een bepaalde hoek en voeg vervolgens kleurbleekmiddel toe totdat er geen paars meer zichtbaar is in het spoelwater. Dit duurt meestal minder dan 10 seconden, of zelfs minder tijd als het bleekmiddel een hoge concentratie aceton bevat. Stop deze stap onmiddellijk, anders zal de kleurstof ook kristalviolet uitlogen uit de grampositieve en negatieve cellen en moet het kleurproces worden herhaald. Spoel overtollig kleurbleekmiddel onmiddellijk af met de vorige techniek.
- Pure aceton (95%+) kan als vervanging worden gebruikt. Hoe meer aceton je gebruikt, hoe sneller het bleekmiddel zal werken, dus je moet meer aandacht besteden aan de timing.
- Als je moeite hebt om de tijd voor deze stap bij te houden, voeg dan druppel voor druppel kleurbleekmiddel toe.
Stap 5. Strooi de tegenkleurstof over het uitstrijkje en spoel het daarna uit
Een tegenkleuring, meestal safranine of fuchsine, wordt gebruikt om het contrast tussen gramnegatieve en grampositieve bacteriën te vergroten door verkleurde (ontkleurde) bacteriën, d.w.z. gramnegatieve bacteriën, roze of rood te kleuren. Laat minstens 45 seconden intrekken, daarna afspoelen.
Fuchsin zal veel gram-negatieve bacteriën intensief kleuren, zoals Haemophilus spp en Legionella spp. Deze methode is goed voor beginners
Stap 6. Droog de dia
U kunt ze in de open lucht drogen of drogen met absorberend papier dat voor dit doel wordt verkocht. Het Gram-kleuringsproces is voltooid.
Methode 3 van 3: De kleurresultaten controleren
Stap 1. Bereid de lichtmicroscoop voor
Plaats het objectglaasje onder de microscoop. Bacteriën variëren sterk in grootte, dus de totale benodigde vergroting varieert van 400x tot 1000x. Voor een scherper beeld is een objectieflens met immersieolie aan te raden. Laat de immersieolie op het objectglaasje vallen en vermijd beweging tijdens het druppelen om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Verplaats het handvat van de microscooplens zodat de objectieflens op zijn plaats klikt en de olie raakt.
Olie-immersie kan alleen worden gebruikt op speciaal ontworpen lenzen, niet op "droge" lenzen
Stap 2. Probeer gram-positieve en gram-negatieve bacteriën te identificeren
Onderzoek het objectglaasje onder een lichtmicroscoop. Gram-positieve bacteriën lijken paars van kleur, omdat het kristalviolet gevangen zit in de dikke celwand. Gram-negatieve bacteriën zullen roze of rood van kleur zijn, omdat het kristalviolet wordt uitgespoeld door de dunne celwanden, waar de roze tegenkleurstof binnenkomt.
- Als het monster te dik is, kan het resultaat een vals positief zijn. Vlek een nieuw monster als het alle gram-positieve bacteriën vertoont, om er zeker van te zijn dat het resultaat correct is.
- Als u te veel kleurbleekmiddel gebruikt, kan het resultaat een vals-negatief zijn. Vlek een nieuw monster als het alle gram-negatieve bacteriën vertoont, om er zeker van te zijn dat het resultaat correct is.
Stap 3. Vergelijk de resultaten die u ziet met de referentieafbeelding
Als je niet weet hoe bacteriën eruit zien, bestudeer dan de verzameling referentiebeelden, meestal gesorteerd op vorm en Gramkleuring. U kunt ook online databases bekijken op [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos en vele andere online sites. Om de identificatie te vergemakkelijken, staan hieronder voorbeelden van bacteriën die vaak worden aangetroffen of die belangrijk zijn voor de diagnose, ingedeeld op basis van hun Gram-status en vorm.
Stap 4. Identificeer grampositieve bacteriën op basis van hun vorm
Bacteriën worden verder geclassificeerd op basis van hun vorm onder de microscoop, meestal als cocci (bolvormig) of staafjes (cilindrisch). Hier zijn enkele voorbeelden van grampositieve bacteriën (paars van kleur) op basis van hun vorm:
- Gram-positieve kokken meestal stafylokokken (betekenis groep kokken) of streptokokken (betekenis keten kokken).
- Grampositieve staafjes zoals Bacillus, Clostridium, Corynebacterium en Listeria. De staafbacteriën Actinomyces spp. hebben meestal takken of filamenten.
Stap 5. Identificeer gram-negatieve bacteriën
Gram-negatieve bacteriën (roze van kleur) worden vaak ingedeeld in drie groepen. Kokken zijn bolvormig, staafjes zijn lang en dun, terwijl coccoïde staafjes er tussenin zitten.
- Gram-negatieve kokken De meest voorkomende is Neisseria spp.
- Gram-negatieve staven bijv. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas en vele anderen. Vibrio cholerae kan worden gezien als een gewone stengel of een gebogen stengel.
- Gram-negatieve "coccoïde" (of "coccobacilli") staafbacteriën bijv. Bordetella, Brucella, Haemophilus en Pasteurella
Stap 6. Controleer zorgvuldig of de resultaten gemengd zijn
Sommige bacteriën zijn moeilijk precies te kleuren vanwege de broosheid of wasachtige aard van hun celwanden. Deze bacteriën kunnen een mengsel van paars of roze vertonen in dezelfde cel, of tussen verschillende cellen in hetzelfde uitstrijkje. Bacteriemonsters ouder dan 24 uur kunnen dit probleem aantonen, maar er zijn ook enkele bacteriesoorten die op elke monsterleeftijd moeilijk te kleuren blijven. Deze bacteriën vereisen meer gespecialiseerde tests voor identificatie, zoals zuurvaste kleuring, observatie in bacteriecultuur, TSI-kweekmedia of genetische tests.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium en Propionibacterium spp. allemaal gram-positieve bacteriën, maar vaak niet duidelijk gekleurd.
- Kleine, slanke bacteriën zoals Treponema, Chlamydia en Rickettsia spp. moeilijk te kleuren met de Gram-methode.
Stap 7. Gooi alle resterende verbruiksartikelen en apparatuur weg
Deze afvalverwijderingsprocedure verschilt per laboratorium en is afhankelijk van de gebruikte materialen. Gewoonlijk wordt de vloeistof in de kleurbak weggegooid in flessen die als gevaarlijk afval zijn geëtiketteerd. Week de objectglaasjes in 10% bleekmiddeloplossing en gooi ze vervolgens weg in een naaldencontainer.
Tips
- Onthoud dat Gramkleuringsresultaten alleen goed zijn als het monster goed is. Het is belangrijk om patiënten te informeren zodat ze een goed monster kunnen afleveren (bijvoorbeeld het verschil tussen spugen versus diep hoesten om een sputummonster te verkrijgen).
- Als kleurbleekmiddel reageert ethanol langzamer dan aceton.
- Houd u aan de standaard laboratoriumvoorschriften om de veiligheid te garanderen.
- Gebruik een wangstaafje om te oefenen, want het bevat zowel grampositieve als gramnegatieve bacteriën. Als u slechts één type bacterie ziet, gebruikt u mogelijk te weinig of te veel bleekmiddel.
- U kunt houten klemmen gebruiken om de glijbaan vast te zetten.
Waarschuwing
- Aceton en ethanol zijn brandbare stoffen. De aceton verwijdert de olie van je handen, waardoor het voor je huid gemakkelijker wordt om andere chemicaliën op te nemen. Draag handschoenen en gebruik ze met zorg.
- Laat het uitstrijkje niet drogen voordat u de Gram-vlek of tegenkleuring hebt afgespoeld.
Wat je nodig hebt
- Netwerkvoorbeeld
- Glazen glijbaan
- Pipet
- Kleine vuurbron, of schuifverwarmer, of methanol
- Water
- Kristalviolet
- Jodium
- Kleur bleekmiddel, zoals alcohol of aceton
- Safranine
